RNA-Seqは、次世代シーケンシング技術を用いたトランスクリプトームのプロファイリング手法です。RNA-Seqにより、それぞれのサンプルに存在するRNA配列を、包括的・定量的に、かつバイアスのない形で提示できます。

マイクロアレイ技術では、Pre-Definedされたプローブセットを用いて、特定のRNA配列がキャプチャ・定量化されます。つまりマイクロアレイでは、あらかじめ選択した転写物のセットを検出できます。RNA-Seqでは次世代シーケンシング技術を駆使して、サンプル内のあらゆるRNA配列の同定・定量化が可能です。

必要とされるリード数は、ゲノムのサイズ、既知の遺伝子の数、転写物の数に応じて異なります。GENEWIZは、小さなゲノム（細菌など）には1,000万リード、大きなゲノム（ヒトやマウスなど）には3,000万リードを推奨しています。リード数が多いほど生成されるシーケンシングデータの量が増え、発現の度合いが低い遺伝子を検出できる確率も高くなります。注記：下流のデータ解析結果の質を確かなものにするためには、十分な量のシーケンシングデータが必要となります。リード数が不十分な場合、解析不能な結果が生み出される可能性があります。

RNA-Seq実験については、GENEWIZでは1×50 bpシングルリード（SR）構成（遺伝子発現レベルの解析を伴うプロジェクト）、ならびに2×100 bpペアエンド（PE）構成（選択的スプライシング転写物といった新規アイソフォームの同定を伴うプロジェクト）を推奨しています。2×100 bp PE構成は、De Novo トランスクリプトームアセンブリを必要とするプロジェクトに対しても推奨されます。

GENEWIZでは、トータルRNAを出発物質として使用するよう推奨しています。ただし、ds-cDNA、mRNA、細胞培養 / ペレットもお引き受けしています。

技術専門家から構成されるGENEWIZの専任プロジェクト管理チームが、実験計画を策定するお手伝いをするほか、RNA-Seqプロジェクトに関する質問にお答えします。

GENEWIZはすべてのプロジェクトにおいて、生データをFASTQファイルとして提供しています。また、高度なバイオインフォマティクス能力を駆使して、以下に挙げるようなデータ解析サービスもオプションも提供しています。

• 参照マッピングおよび生ヒットカウント測定：個々のサンプルの発現レベルで特定
• 差次的遺伝子発現解析：複数のサンプルにわたって発現レベルを統計的に比較
• 新規アイソフォーム同定：既知および未知のアイソフォーム（選択的スプライシング転写物）を検出

また、GENEWIZはリファレンスを持たない配列に対し、De Novoトランスクリプトームアセンブリーもご提供しています。 

カスタムデータ解析がご必要な場合は、RNA-Seq見積リクエストフォームの「プロジェクトに関する説明」セクションに解析要件を記してください。

GENEWIZ RNA-Seqサンプル提出フォームにご記入のうえ、サンプルにドライアイスを添えて以下までお送りください。 

はい。RNA-Seqプロジェクトにおいて、ds-cDNAを出発物質としてご利用になれます。ただしds-cDNAを用いる場合、完全な品質管理は不可能であることをご了承ください。その際、少なくとも1 µgのds-cDNA（濃度 50 ng/µl）が必要です。

はい。出発物質としてmRNAをご利用になれます。ただし、ライブラリー構築プロセスを始める前に品質チェックを行うことはできません。開始するにあたり20 ngを超えるmRNAが必要となります。サンプルはヌクレアーゼフリー水で溶出または再懸濁させる必要があります。

totalRNAサンプルには以下の要件が適用されます。

• 総量：≥ 5 μg µg 
• 濃度：≥ 80 ng/μlµl
• OD260/280範囲：1.8～2.2
• ヌクレアーゼフリー水への再懸濁

はい。充填準備の整ったライブラリーのシーケンシングも可能です。少なくとも15 µlのライブラリー（濃度10 nM）を氷に載せてお送りください。

GENEWIZは通常、真核生物サンプルのRNA転写物のエンリッチメントにポリA選択法を使用しますが、その代替手段であるリボソームRNA（rRNA）枯渇法の方が効果的な場合もあります。たとえば、大量のRNAが含まれる種からtotalRNAを抽出する場合、rRNAの枯渇処理が効果を発揮します。さらに、数種類のノンコーディング要素（ロングまたはショートncRNAなど）を検出する場合も、rRNA枯渇法の使用が推奨されます。
原核生物サンプルについては、GENEWIZではいずれのプロジェクトにおいてもrRNAに枯渇処理を施します。

GENEWIZでは、サンプルごとに一定のリード数の提供を保証をしています。目安として、Illumina HiSeq 2500のラピッドランモードでは1レーンあたり1億2,000万リード、高出力モードでは1レーンあたり2億5,000万リードの提供が保証されています。

GENEWIZでは、出発物質が最低分量に満たない場合でも作業を行える可能性があります。RNA-Seq見積リクエストフォームの「プロジェクトに関する説明」セクションで、プロジェクトの要件を記入してください。

GENEWIZでの作業の進捗状況は、サンプルの受領時、および品質管理結果の確認時に更新いたします。その後、GENEWIZはプロジェクトの全期間にわたって情報を毎週更新します。

raw hit countは、特定のゲノム機能（通常は遺伝子または転写物）に対してリード数を正確にカウントすることで算出します。

お客様の機密と知的財産（IP）の保護はGENEWIZの最優先事項です。GENEWIZ側で完了したあらゆるプロジェクトのセキュリティとプライバシーはしっかりと守られるのでご安心ください。詳しくは、GENEWIZの機密保持ポリシーをご覧ください。

これまでシーケンシングされたことのないゲノムは、シーケンシングの後、De Novoで組み立てる必要があります。

De Novo アセンブリーは、シーケンスのアセンブリー後にも残っているギャップを埋める必要がある場合において、バイオインフォマティクスにおける課題となる可能性があります。

アセンブリープロセスの最中には、コンティグと呼ばれる、シーケンスリードの重複によって形成される大きなDNAシーケンスが生まれます。次世代シーケンシング（NGS）は、フラグメント化した核酸をシーケンシングすることで機能するため、コンティグ間にギャップが生じます。

次世代シーケンシングの用途のひとつであるターゲットリシーケンシングでは、シーケンシングにおいて関心のある領域にエンリッチメント（フォーカス）を行います。

全ゲノムのサイズは非常に大きくなることがあります。ターゲットリシーケンシングによって、詳細を知る必要のない領域を除外することで、初期ターゲットサイズを小さくできます。特定のNGSプラットフォームおよび構成の出力は一定であるため、ターゲットサイズが小さくなると、柔軟性をもってより多くのサンプルを同一のランに多重化したり、より深いカバレッジでシーケンシングを実施したりできようになります。

多重化能力が向上すると、より多くのサンプルを単一のランでシーケンシングできるようになるため、（サンプルあたりのコストが大幅に減って）プロジェクトの費用効果が高まります。

カバレッジが深くなると、アッセイの感度も上がります。この高い感度によって、まれにしか発生しない低頻度の変異をより効果的に検出できるようになります。また、より複雑なゲノム領域（GCリッチまたはATリッチ領域など）の解決も可能となります。

エクソームシーケンシングは、ターゲットリシーケンシングの一種です。ただし、ターゲットサイズは大半のカスタムターゲットアッセイよりも大幅に大きいものとなります。そのため、全ゲノムシーケンシングと同様の効果を得られます。

ターゲットリシーケンシングには主に、ターゲットエンリッチメントとアンプリコンシーケンシングの2種類があります。ターゲットエンリッチメントでは、完全ゲノムライブラリーの作成に続き、ベイトを用いて関心部位をキャプチャします。これとは対照的に、アンプリコンシーケンシングでは高度に多重化されたPCR反応において、非フラグメント化ゲノムDNAの標的部位を直接増幅します。さらに、ターゲットエンリッチメントおよびアンプリコンシーケンシング技術は、各社（Illumina、Agilent、Life Technologiesなど）が設計したものを含めると数種類に及びます。

アッセイ設計プロセスは、比較的な単純なものから非常に複雑なものまでさまざまです。

設計プロセスに影響を及ぼす主な要素の例として、以下が挙げられます。

• アンプリコンシーケンシングとターゲットエンリッチメントのいずれを使用するかの判断
• 最良のアンプリコンまたはエンリッチメントのケミストリー / テクノロジーに関する判断
• 特定の領域 / 遺伝子の最良設計についての判断（例：GCリッチ領域または複雑な構造が続く領域は、シンプルな領域とは異なる方法で処理する必要があります）

GENEWIZが持つターゲットアッセイ設計に関する幅広い経験は、特定の用途向けに自社開発された複数のパネル（がん研究用に最適化されたOncoGxOne™ディスカバリがんパネルなど）にも反映されています。

GENEWIZが得意とする分野の一例として以下が挙げられます。

• 複雑なアッセイ設計における実績
• プロジェクトのコンサルティングと技術サポートに関する専門知識
• あらゆる主要ターゲット技術に関する豊富な経験と高い対応能力
• コピー数多型（CNV）を探索するための自社特有の高度なバイオインフォマティクスパイプライン
• 遺伝子再構成を探索するための自社特有の高度なバイオインフォマティクスパイプライン

考えられる用途の一例として以下が挙げられます。

• 一般的な遺伝子変異およびまれな遺伝子変異の探索（点変異、挿入欠損、コピー数多型（CNV）、遺伝子融合など）
• 特定の表現型との遺伝的関連性の特性化（病態や薬剤反応など）
• 細胞株の分類 / 区分（真核細胞と原核細胞の双方を含む）
• 抗体の探索（ファージディスプレイライブラリーとインビトロセレクションの双方を含む）
• 遺伝子検査（薬理ゲノミクスや腫瘍アッセイなど）

詳しくは、プロジェクトマネージャー（PM@genewiz.com）にお問い合わせください。

がんパネルとは、次世代シーケンシングを用いてがんに特異的な遺伝子を選択的にシーケンシングするための、あらかじめ設計された遺伝子パネルです。

用途の一例として以下が挙げられます。

• がんのメカニズムの解析
• まれな体細胞変異の探索（がんドライバーを含む）
• バイオマーカーの探索
• 治療標的の探索
• 臨床試験における患者の層別化

全ゲノムシーケンシングにおいては、たとえ中程度のカバレッジを実現するだけでも、極めて大量のシーケンシングスループットが必要となります。生成されるデータは包括的でありながらも、ターゲットアプローチと同等の感度をもってしても変異を検出することはできません。

エクソームシーケンシングは、全ゲノムのおよそ1～2%を標的とするターゲットアプローチです。そのため、より多くのデータが生成され、深いカバレッジによって感度も向上しています。

がんパネルは、エクソームシーケンシングターゲットのごく一部を標的とします。そのためカバレッジは一層強化されており、非常にまれな変異さえも効果的に検出する感度を備えたアッセイができ上がります。（がんドライバーであることが多いことが示されている）体細胞変異は、非常に低い頻度でしか発生しない傾向があるため、これはがんの検出において欠かせない要素となります。

GENEWIZは主に以下の2種類のがんパネルを提供しています。

1.がんホットスポットパネル

2.OncoGxOne™ディスカバリがんパネル

TruSeqアンプリコンがんパネルおよびIon AmpliSeq™がんホットスポットパネルは、がんホットスポットパネルに分類されます。

がんホットスポットパネルは、突然変異ホットスポットとして入念に特性化された48～50の遺伝子から成る領域を標的としています。これは、これらの遺伝子のエクソン領域のごく一部となります。アッセイ対象の遺伝子は、さまざまな種類のがんにわたって共通のものとなっています。標的を定める工程には、アンプリコンシーケンシングと呼ばれる技術が用いられます。ここでは、設計済みのプライマーをハイブリッド化させ、高度に多重化されたPCR反応のもと、関心のある領域を非フラグメント化ゲノムDNAに隣接させます。がんホットスポットパネルにより、点変異や小さな挿入欠損に関する情報を入手できます。

OncoGxOne™ディスカバリがんパネルは、すべてのエクソン、すべてのUTR、そしておよそ150～400の遺伝子から成る転座切断点が判明しているイントロンを標的とします。遺伝子の正確な数は19種類あるパネルごとに異なります。それぞれのパネルは、個々の種類のがんに特有のものとなっています。この技術では、ターゲットエンリッチメントと呼ばれる、完全に準備されたゲノムライブラリーに対して、設計済みのビオチン化ベイトをハイブリッド化し、関心のある領域を引き出すという手法を用いて標的が定められます。OncoGxOne™ディスカバリがんパネルにより、点変異、挿入欠損、コピー数多型（CNV）、遺伝子融合に関する情報を入手できます。

これらの2種類のオプションには長所と短所があります。たとえば、OncoGxOne™ディスカバリがんパネルは包括的な検出が可能ですが、データの生成に時間と費用がかかります。

当社の熟練プロジェクトマネージャーが、お客様の状況とプロジェクトについてお聞きしたうえで、最適な方法を特定するお手伝いをいたします。

主な特徴として以下が挙げられます。

• 個々のがんの種類に合わせて特別に設計されたパネル
• （広範囲にわたる文献の調査およびデータベースのマイニング / レビューを経て）エキスパートが精選したがん遺伝子　/ ゲノム領域
• 市場で最も包括的ながんパネル
• まれにしか発生しない低頻度の体細胞変異を検出する能力
• 点変異と挿入欠損に加え、コピー数多型（CNV）と遺伝子融合も検出する能力

OncoGxOne™ディスカバリがんパネル、ならびにがんホットスポットパネルの遺伝子リストについては、プロジェクトマネージャー（PM@genewiz.com）または現地の販売代理店までお問い合わせください。

どのプロジェクトにおいても、生データはFASTQファイル形式でお届けします。

がんホットスポットパネルを用いたプロジェクトについては、いただいたサンプル内に検出された点変異と挿入欠損に関する詳細レポートもお渡します。これは、すべてのプロジェクトに付属しています。

OncoGxOne™ディスカバリがんパネルについては、点変異、挿入欠損、コピー数多型（CNV）、遺伝子融合に関する詳細レポートもオプションでご提供します。

また、ご要望に応じてカスタムレポートもご利用になれます。その場合、フォームの「プロジェクトに関する説明」セクションにご希望の内容を記入してください。

他にもご質問がある場合は、電子メール（PM@genewiz.com）でお問い合わせください。当社の熟練プロジェクトマネージャーが誠意をもって対応いたします。

OncoGxOneディスカバリがんパネルは、主な種類のがんに関連するゲノム異常を包括的にアッセイすることを目的に、GENEWIZが独自に特別開発した遺伝子パネルです。

OncoGxOneディスカバリがんパネルには、一例として以下に挙げるような多くの用途が考えられます。

• がんのメカニズムに関する研究（突然変異を促す新規物質の特定）
• 治療標的の探索
• バイオマーカーの探索
• 臨床試験における患者の層別化
• 個別がん治療に関する情報

OncoGxOneディスカバリがんパネルの主な特徴として以下が挙げられます。

• 個々のがんの種類に合わせて特別に設計されたパネル
• （広範囲にわたる文献の調査およびデータベースのマイニング / レビューを経て）エキスパートが精選したがん遺伝子 / ゲノム領域
• 市販されている他のどのがん特異的パネルよりも包括的
• 低頻度でしか発生しない変異を検出する能力
• 4種類すべてのゲノム異常（点変異、挿入欠損、遺伝子融合、コピー数多型（CNV））を検出する能力

標準的なOncoGxOneディスカバリがんパネルには、およそ250種類のがん特異的遺伝子（既知のがんドライバー遺伝子を含む）が含まれており、その数はパネルごとに異なります（150～350種類）。各パネルのがん遺伝子の選定においては、非常に広範囲にわたる文献の調査とデータベースのマイニング、そして専門家による精選と大規模なレビューが実施されるため、その科学的妥当性、包括性、関連性は確証済みです。データマイニングに用いられるデータソースの例として、がん遺伝子に関する情報が含まれるあらゆる主要データベース（COSMIC、CGC、TCGA、CGAP/Mitelman、OMIM、HMD、TTD、そしてDrugBankなどの公表がんパネルや主要出版物）が挙げられます。

GENEWIZは現在、以下の19種類の主ながんに対してアッセイを用意しております。

• 膀胱がん
• 脳腫瘍
• 乳がん
• 子宮頸がん
• 結腸直腸がん
• 子宮内膜がん
• 食道がん
• 胃がん
• 頭頚部がん
• 腎臓がん
• 白血病
• 肝臓がん
• 肺がん
• リンパ腫
• 黒色腫
• 卵巣がん
• 膵臓がん
• 前立腺がん
• 甲状腺がん

GENEWIZでは、ご要望に応じて他の種類のがんに対するアッセイも開発いたします。

• 短い納期
• 低コスト
• 低頻度でしか発生しない変異を検出
• イントロン領域で発生する遺伝子融合を検出
• より正確にコピー数多型（CNV）を検出

特別設計：既製のがんパネルは汎用的な遺伝子パネルであり、対象のがんの種類とは関係がない可能性のある遺伝子も多く含まれていますが、OncoGxOne™ディスカバリがんパネルは、それぞれが個々の種類のがんをアッセイするよう特別設計されています。

より包括的： 標準的なOncoGxOne™ディスカバリがんパネルにはおよそ250種類のがん遺伝子が含まれている一方、既製のものは50種類ほどにしか過ぎません。さらに、これらの50種類ほどの遺伝子は、対象のがんと関連がない可能性もあります。 

GENEWIZ OncoGxOne™ディスカバリがんパネルは遺伝子のエクソン領域をアッセイしますが、ご要望に応じて特定のイントロン領域をアッセイすることも可能です。これとは対照的に、既製のがんパネルは一定数のホットスポットしかアッセイできません。 

より多種のゲノム異常を検出： 当社独自のパネル設計とバイオインフォマティクス技法が組み込まれたOncoGxOne™ディスカバリがんパネルは、4種類すべてのゲノム変化（点変異、挿入欠損、遺伝子融合、コピー数多型（CNV））を検出できる一方、既製のがんパネルで検出されるのは点変異と挿入欠損に限定されています。

GENEWIZはターゲット配列のエンリッチメントにおいて、SureSelectプローブ型キャプチャアッセイを採用しています。データ生成にはMiSeq/HiSeqを使用しています。

GENEWIZは遺伝子融合を検出するため、考えられ得るすべての既知の融合部位の付近にSureSelectプローブを設置し、バイオインフォマティクス技法を効果的に用いて遺伝子融合の場所とパートナー遺伝子を同定しています。コピー数多型（CNV）の検出の評価においては、制御遺伝子とお客様のサンプルデータのプールから生成した「背景制御」を、独自のバイオインフォマティクス手法と併せて利用しています。また、同一の被験者から入手した対照サンプル（通常はお客様から提供される血液サンプルなど）を用いて、精度の向上に努めています。さらに、追加的な検証に向けた他のCNVアッセイ法として、qPCRサービスもご提供しています。

はい。サービスのご利用を検討されているお客様には、当社のすべてのがんパネルの遺伝子リストを提示いたします。また、イントロン領域を隠した状態で、これらの遺伝子を詳しくお見せすることも可能です。遺伝子リストは定期的に更新されますので、お客様のご要望に応じて遺伝子を追加することもできます。’ request.

ここでは、エクソームとは全ヒトゲノムに含まれるすべてのコーディング領域（エクソン）と定義されています。

エクソームシーケンシングとは、ターゲットエンリッチメント、そしてその後の全エクソームのシーケンシングを指します。エクソームシーケンシングは研究団体にとって、表現型（疾患など）に関連する遺伝子変異を同定するための最も強力なツールとなる可能性を秘めています。

全ゲノムシーケンシングにおいては、たとえ中程度のカバレッジを実現するだけでも、極めて大量のシーケンシングスループットが必要となります。生成されるデータは包括的でありながらも、ターゲットアプローチと同等の感度をもってしても変異を検出することはできません。エクソームシーケンシングは現行のシーケンシング技術と併用することで、最も費用効果的かつ効率的なソリューションとなります。

重要な突然変異の大部分はエクソームで発生しています。実際に、疾患関連変異の85%はエクソームに含まれています。エクソームは全ゲノムの2%未満にしか過ぎないため、そのシーケンシングにおいては50分の1のスループットで通常のシーケンシングと同じカバレッジの深さを実現できます。エクソームシーケンシングでは低いシーケンシングスループットしか必要としないことから、柔軟な実験オプションを採用できます。

1. 同じ深さのカバレッジを維持しつつ、より多くのサンプルを同一のレーンに多重化することで、プロジェクトの総費用を大幅に削減できる

2. カバレッジの深さを高めて、まれにしか発生しない低頻度の突然変異の検出を促進する

3. 1と2の組み合わせ。

GENEWIZは長年にわたって優れたサービスを提供するという揺るぎないコミットメントを実践してきたことで、DNAシーケンシングおよびゲノミクスにおけるグローバルリーダーとしての地位を確立しました。さらに、エクソームシーケンシングなどの次世代シーケンシング技法に関する幅広い経験と専門知識も備えています。お客様のプロジェクトを最適化するにあたり、当社の熟練プロジェクトマネージャーが仕様の決定についてお手伝いをいたします。

16Sメタゲノミクスは、次世代アンプリコンシーケンシングを用いて、16S rRNA遺伝子の特異的超可変領域をターゲットにする技法です。

16Sメタゲノミクスは、サンプル内に存在する細菌種と古細菌種の種類と相対存在量を特定するために用いられます。これは、土壌やマイクロバイオーム（腸内フローラなど）といった、異種サンプルを処理する際に効果的な手法となります。

現行の16Sメタゲノミクス技法は、単一のプライマーペアを用いて、16S rRNA遺伝子の超可変V4領域をターゲットにしています。16S MetaVx™では、独自のプライマー設計によってこの機能が改良されており、16S rRNA遺伝子の超可変V3、V4、V5領域をターゲットとすることができます。

16S MetaVx™による解析を現行の16Sメタゲノミクスと比較した場合、16S MetaVx™はより高い感度と特異性を発揮することで、数々のサンプルにわたり、一貫してより多くの細菌属 / 古細菌属を同定することができました。

また現行の16Sメタゲノミクス技法では、そのアンプリコン設計に起因するシーケンス多様性の低さに対処するため、15%以上のDNAスパイクインが必要ですが、これによって、かなりの量のシーケンシングスループットがオフターゲットのカバレッジへと分散してしまいます。一方16S MetaVx™はその独特な設計により、DNAスパイクインは不要であるため、シーケンシングスループットのすべてをターゲット領域にのみ当てることができます。

当社のプロジェクト管理チーム にお問い合わせのうえ、（同一のサンプルを同一条件のもと、2種類のアプローチでシーケンシングした）比較解析の結果をご覧ください。いずれの場合においても、16S MetaVx™の方が優れていることがうかがえます。

細菌種と古細菌種の種類と相対存在量を示した円グラフを、生データと共にお届けします